Sulla base di ampi studi a lungo termine, gli analiti virali nel plasma dimostrano una stabilità eccezionale se conservati a o sotto i -70°C. Ricerche specifiche che hanno monitorato campioni di plasma per 11-20 anni non hanno riscontrato alcun deterioramento rilevabile o perdita di reattività per marcatori virali critici, inclusi l'antigene di superficie dell'epatite B (HBsAg), gli anticorpi anti-HIV (anti-HIV) e gli anticorpi anti-HCV (anti-HCV). Questo rende -70°C lo standard definitivo per la biobanca virale a lungo termine.
Il principio fondamentale è che a temperature ultra-basse, i processi biologici e chimici che degradano i campioni sono efficacemente congelati nel tempo. Ciò consente la conservazione di proteine virali, anticorpi e acidi nucleici per decenni, a condizione che le condizioni di conservazione rimangano costanti.
Perché -70°C è lo standard aureo per la stabilità
La scelta di -70°C non è arbitraria; si basa su principi biofisici fondamentali che arrestano la degradazione del campione. Questa temperatura funge da soglia critica per preservare l'integrità molecolare dei campioni biologici.
Arresto dell'attività enzimatica
A temperature intorno a -70°C, il movimento molecolare dell'acqua diventa così limitato da essere essenzialmente non disponibile per le reazioni chimiche. Questo stato, noto come fase di "transizione vetrosa", arresta efficacemente l'attività di enzimi come proteasi e nucleasi che altrimenti degraderebbero le proteine virali e il materiale genetico.
Prevenzione del danno da cristalli di ghiaccio
Sebbene il congelamento a qualsiasi temperatura crei cristalli di ghiaccio, il raffreddamento rapido a temperature ultra-basse si traduce nella formazione di cristalli più piccoli e meno dannosi rispetto alla conservazione a -20°C. Ciò preserva meglio le delicate strutture di proteine e anticorpi.
Un punto di riferimento storico comprovato
Per decenni, i congelatori a temperatura ultra-bassa impostati a -65°C o -70°C sono stati la pietra angolare della ricerca medica e della biobanca. Questa lunga storia fornisce un'enorme quantità di prove empiriche che confermano la stabilità a lungo termine di un'ampia gamma di analiti biologici, inclusi quelli derivanti da virus.
Prove di stabilità multi-decennale
L'affidabilità della conservazione a -70°C non è solo teorica. È supportata da studi osservazionali diretti e a lungo termine su campioni di pazienti inestimabili.
Stabilità delle proteine virali e degli anticorpi
Le prove più dirette provengono da studi sui marcatori sierologici. In diversi rapporti, campioni di plasma conservati costantemente a -70°C per periodi che vanno da 11 a 20 anni non hanno mostrato alcuna perdita di segnale per HBsAg, anti-HIV e anti-HCV. I campioni si sono comportati in modo identico a quelli appena raccolti.
Stabilità degli acidi nucleici virali
Questo stesso principio di arresto della degradazione enzimatica si applica all'RNA e al DNA virale. La conservazione a temperatura ultra-bassa è lo standard per preservare il materiale genetico virale per applicazioni come i test del carico virale basati su PCR, la genotipizzazione e il sequenziamento. Disattiva efficacemente le RNasi e le DNasi presenti nel plasma che distruggerebbero rapidamente gli acidi nucleici a temperature più calde.
Comprendere i fattori critici e le insidie
Il raggiungimento di una stabilità multi-decennale non riguarda solo la temperatura in sé, ma anche l'integrità del processo di conservazione. Diversi fattori possono compromettere la vitalità a lungo termine di un campione.
Il nemico primario: cicli di congelamento-scongelamento
La più grande minaccia all'integrità del campione non è la durata della conservazione, ma il numero di volte in cui viene scongelato e ricongelato. Ogni ciclo di congelamento-scongelamento sottopone le proteine a stress meccanico dovuto alla formazione di cristalli di ghiaccio e consente brevi periodi di attività enzimatica, portando a danni cumulativi e a una potenziale perdita di reattività dell'analita.
Le fluttuazioni di temperatura contano
I campioni sono più vulnerabili durante le fluttuazioni di temperatura. Un congelatore ultra-basso affidabile con un robusto monitoraggio della temperatura, allarmi e una fonte di alimentazione di backup è essenziale. Anche lievi aumenti di temperatura, se sostenuti, possono accelerare la degradazione nel corso di anni.
L'aliquotazione iniziale è essenziale
Per evitare cicli distruttivi di congelamento-scongelamento, la migliore pratica prevede che i campioni siano divisi in volumi più piccoli, o aliquote, al momento della lavorazione iniziale. Ciò consente ai ricercatori di scongelare solo la piccola quantità necessaria per un esperimento specifico, lasciando lo stock principale intatto e perfettamente conservato.
Implementare una strategia di conservazione robusta
Il vostro approccio alla conservazione dovrebbe essere dettato dai vostri obiettivi scientifici o diagnostici a lungo termine. Una pianificazione adeguata garantisce che i vostri campioni rimangano una risorsa preziosa per gli anni a venire.
- Se il vostro obiettivo principale è il test sierologico (anticorpi/antigeni): potete avere grande fiducia nei risultati di campioni conservati costantemente a -70°C per un massimo di 20 anni, come dimostrato in studi a lungo termine.
- Se il vostro obiettivo principale è il test degli acidi nucleici (es. carico virale): -70°C è lo standard richiesto per la conservazione a lungo termine, in quanto è il modo più efficace per arrestare l'attività delle nucleasi che degradano l'RNA e il DNA virale.
- Se state creando una nuova biobanca: date priorità all'aliquotazione di tutti i campioni al momento della raccolta iniziale e investite in un congelatore ultra-basso di alta qualità e monitorato per eliminare i rischi di fluttuazioni di temperatura e cicli di congelamento-scongelamento.
In definitiva, la conservazione costante a -70°C trasforma il plasma da campione deperibile in una risorsa stabile e a lungo termine per la ricerca e la diagnostica.
Tabella riassuntiva:
| Analita chiave | Stabilità dimostrata a -70°C | Prova chiave |
|---|---|---|
| Antigene di superficie dell'epatite B (HBsAg) | Fino a 20 anni | Nessuna perdita di reattività in studi a lungo termine |
| Anticorpi anti-HIV (anti-HIV) | Fino a 20 anni | Segnale consistente identico a campioni freschi |
| Anticorpi anti-HCV (anti-HCV) | Fino a 20 anni | Nessun deterioramento rilevabile nel corso dei decenni |
| Acidi nucleici virali (RNA/DNA) | Lungo termine (standard del settore) | Arresta efficacemente la degradazione delle nucleasi |
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